پدر و مادرش کشاورزانی فقیر بودند. ابتدا مدت کوتاهی، طی جنگ جهانی دوم، به عنوان نقشه کش کار کرد. در همین دوره توسط نیروهای اشغالگر آلمانی به یک اردوگاه کار اجباری فرستاده شد. اما از اردوگاه فرار کرد و تا پایان جنگ در یک اتاق زیر شیروانی در شهر ونیز پنهان شد.

پس از جنگ به رُم رفت. در حالی که روزها به عنوان فروشنده مشغول به کار بود، شب ها با گروه های دانشجویی روی صحنه می رفت. از 1947، به طور حرفه ای در یک نسخه ی ایتالیایی از «بینوایان» جلوی دوربین رفت. یک سال بعد به گروه تئاتری لوکینو ویسکونتی پیوست. خیلی زود هم روی صحنه و هم روی پرده مورد توجه قرار گرفت. از اواسط دهه ی 1950 با بازی در فیلم هایی مثل «شب های روشن» ویسکونتی (1957)، «زندگی شیرین» (1960) و «هشت و نیم» فدریکو فلینی (1963)، «شب» میکل آنجلو آنتونیونی (1060) و «طلاق به سبک ایتالیایی» پیترو جرمی (1962) به شهرت بین المللی دست پیدا کرد. اغلب در نقش های درام یا کمیک ظاهر می شد. برای «طلاق به سبک ایتالیایی»، «یک روز بخصوص» و «چشم های سیاه» نامزد دریافت اسکار بهترین بازیگر نقش اول شد. جایزه بهترین بازیگر را از جشنواره کن برای فیلم های «درام حسادت» و «چشم های سیاه» از آنِ خود کرد. همسرش، فلورا کارابلا (از 1948 تا زمان مرگ ماسترویانی) نیز بازیگر بود. از کاترین دنوِ  بازیگر یک دختر داشت. بر اثر ابتلا به سرطان لوزالمعده درگذشت.

ماسترویانی بی تردید تنها بازیگر مرد سینمای ایتالیاست که از حیث شهرت و محبوبیت میان غیرایتالیایی ها همپای دو بازیگر زن ایتالیایی (سوفیا لورن و جینا لولوبریجیدا) است. سیمای مغموم و نگاه سرگردانش، او را برای هر تماشاگری جذاب و برای هر کارگردانی ایده آل ساخته بود. او چیزی فراتر از یک عاشق رمانتیک لاتینی به نظر می آمد. برای ایفای نقش کارمند گیج و ترسوی داستان «شب های سپید» فئودور داستایفسکی مناسب ترین انتخاب بود و این گیجی، سرگشتگی و آشفتگی، یکی از وجوه پرسونای سینمایی او را شکل داد. به طوری که اساساً برای ایفای نقش های اگزیستانسیالیستی، از «بیگانه» آلبر کامو تا «شب» آنتونیونی، بهترین و باارزش ترین بازیگری است که سینما به خود دیده است. همچنین در بازی در هجویه ی این گونه نقش ها نیز توانایی هود را نشان داد (اپیزود دوم «دیروز، امروز، فردا» - 1963). ماسترویانی در تلفیق این سرگشتگی با طنز مورد نظر فلینی استاد بود و بنابراین در دو فیلم مهم فلینی -«زندگی شیرین» و «هشت و نیم» - بهترین بازی های خود را ارائه داد.

از طرفی دیگر او در ایفای نقش های کمدی های صِرف مثل «دیروز، امروز، فردا» و «طلاق به سبک ایتالیایی» نیز توانا و چیره دست بود. از نیمه ی دهه ی 1950 او و سوفیا لورن یک زوج درخشان و جذاب سینمایی را تشکیل دادند که هم در ایتالیا و هم در خارج از آن بغایت محبوب بود. در اغلب این آثار چه کمدی و چه رمانتیک (مثل «گل آفتابگردان»، 1970) مارچلو نقش مردی منفعل، تنبل و بی تفاوت نسبت به آنچه بر سرش می آید را ایفا می کرد و لورن نقش زنی پرشور و عاشق زندگی که برای بقای خود و مارچلو تلاش می کند و به جای هر دویشان تصمیم می گیرد. آنها تصویری ازلی- ابدی از یک زوج ایتالیایی را به نمایش گذاردند. اما از طرفی مارچلو مظهر مرد مدرن و روشنفکرِ سرگردان و دچار بحران. رابرت آلتمن در «لباس حاضری» مجدداً لورن و ماسترویانی کنار هم قرار داد، که این بار هم هر دو در هجو آثار قبلی خود کماکان موفق بودند.