جمشيد مشايخی، دارای تحصيلات ناتمام در رشته تئاتر است. وی سال 1336 به استخدام اداره تازه تاسيس هنرهای دراماتيک در آمد و به عنوان بازيگر كار خود را در برنامه نمايشی «كانال سوم غير دولتی» آغاز كرد و با ايفای نقش در فيلم كوتاه «جلد مار» به کارگردانی هژير داريوش به همراه فخری خوروش جلوی دوربين رفت. او حتی به خاطر بازی ها و حضورش در سینما برای مدتی از كار تئاتر اخراج شد.

سینما را با «خشت و آیینه» (ابراهیم گلستان-1344) آغاز کرد و تا پیش از آن، یک تئاتری دوآتشه بود؛ آنقدر شیفته که کار اداری را هم به خاطر تئاتر رها کرد. مشایخی روح ناآرامی داشت. در خدمت سربازی تاب نیاورد و از دانشگاه هم انصراف داد اما تئاتر، مکانی بود برای روح ناآرام و بیقرار جمشید مشایخی که حالا از مفاخر سینما و تئاتر ماست. او وارد اداره تولید تئاتر شد؛ به همراه خیلی‌های دیگر؛ به همراه عزت الله انتظامی، علی نصیریان و جعفر والی.

«خشت و آیینه» او را به سینما برد اما باعث نشد که تئاتر را رها کند و تا سال‌های سال بعد، او همچنان به تئاتر وفادار ماند. با این که نقشش در «خشت و آیینه» کم بود، اما همواره از مشکل‌بودن نقشش یاد می‌کند و با احترام از کارگردان آن نام می‌برد. فیلم، آغاز جریان روشنفکری در سینمای ایران بود و مشایخی، بازیگری نام گرفت که در این جریان فیلمسازی، بازیگری می‌کند.

بعد از انقلاب، او مدتی مدیر اداره تئاتر شد تا اینکه بیماری باعث شد از نمایشی در حال تمرین بیرون برود و بعد از آن، نمایش دیگری کار نکرد تا چند سال پیش. با اینکه حکم استخدامی او در اداره تئاتر ،کارگردانی است اما او تنها یک نمایش را کارگردانی و تمام وقتش را صرف بازیگری کرد.

نقش کمال‌الملک را با استادی هرچه تمام بازی کرد؛ انگار خود استاد بود. عرب‌زاده شاگرد استاد نقاش هم به او گفت که نقش استادش را خوب بازی کرده؛ فقط قد جمشید مشایخی، کمی کوتاه‌تر از کمال‌الملک بود. جمشید مشایخی نقش‌های ماندگاری در سینمای ایران ایفا کرد؛ از نقشش در «قیصر» گرفته تا «یک بوس کوچولو». همچنین او با گروهی از بهترین کارگردان های سینمای ایران همکاری کرده است.

به گفته ی علی حاتمی، او بهترین کسی است که دیالوگ‌های شاعرانه‌اش را می‌گوید. دیالوگ‌هایش در «سوته‌دلان» را به یاد بیاورید یا در «هزاردستان» و حتی «کمال‌الملک» را. مشایخی در اکثر فیلم‌های علی حاتمی حضور داشت و حاتمی، بهترین نقش‌هایش را برای او می‌نوشت. این دو در پنج فیلم با همدیگر همکاری کردند. در «دلشدگان» هم قرار بود جمشید مشایخی حضور داشته باشد ولی قراردادش با سریال «پیک سحر» مانع از آن شد. در «مادر» هم به همین شکل. در «تختی» - آخرین فیلم حاتمی‌ که نیمه‌کاره ماند - هم نقش داشت اما مشایخی دلیل این عدم همکاری را شیطنت عده‌ای می‌داند که نمی‌خواستند او و حاتمی همکاری کنند. 

جمشید مشایخی فیلم‌هایش با حاتمی را بیشتر از بقیه کارهایش دوست دارد. می‌گوید: "حاتمی، سعدی سینماست؛ در سینما شعر می‌گوید." و مشایخی، شعر را بیش از سینما دوست دارد و علاقه‌اش به حافظ و مولانا بسیار است. پس از فیلم‌های حاتمی، «روز واقعه» را دوست دارد و بعد از آن «طلسم» را.

مشایخی دارای سه فرزنداست: نادر، نغمه و سام. شاید شناخته‌ شده‌ ترین آنها نادر مشایخی باشد. نادر سال‌ها در اتریش موسیقی خوانده و ارکسترهای مختلفی را رهبری کرده است. شاید وجه تشابه بهترین بازیگران سینمای ایران همین باشد؛ فرزندان مشایخی و انتظامی، هر دو از بهترین آهنگسازان ایران هستند.

مشایخی، از بازیگران نسل بعد از خود، خسرو شکیبایی و پرویز پرستویی را خیلی دوست دارد. مشایخی به گفته خودش، هیچ برنامه‌ای برای آینده کاری‌اش در بازیگری ندارد چرا که دیگر نقش‌های خوبی به او پیشنهاد نمی‌شود. مشایخی می‌خواهد انتظارها را برآورده کند اما فضای آن ایجاد نمی‌شود: "باید دنبال کار دیگری بگردم؛ کاری که اصلا هنری نباشد. عرصه هنر دیگر به من احتیاج ندارد. دوست دارم گوشه‌ای بنشینم و کتاب بخوانم. می‌خواهم بنان و شجریان گوش کنم."

از جمشید مشایخی در فرانسه تقدیر به عمل آمد؛ همچنین در شب حافظ که هرساله در پاریس برگزار می‌شود. در این مراسم از هانری دوفوشه کور- حافظ‌شناس برجسته - تقدیر شد و مشایخی هم نماینده ایران بود. به هر حال، او در تمام گفته‌های اخیرش از عدم علاقه به بازیگری می‌گوید. مشایخی حالا دغدغه‌های دیگری دارد؛ موسیقی، شعر، کتاب و نقاشی.